Gehirn

Nature Band 609, Seiten 822–828 (2022)Diesen Artikel zitieren

35.000 Zugriffe

10 Zitate

206 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Der Wirkstoffeingriff auf das Zielgewebe und außerhalb des Gewebes ist eine wichtige Quelle unerwünschter Wirkungen, die das therapeutische Fenster von Arzneimittelkandidaten einschränkt1,2. Bei Erkrankungen des Zentralnervensystems sind Arzneimittel mit hirnbeschränkter Pharmakologie äußerst wünschenswert. Hier berichten wir über eine Strategie zur Hemmung des Säugetierziels von Rapamycin (mTOR) bei gleichzeitiger Schonung der mTOR-Aktivität an anderer Stelle durch den Einsatz des gehirndurchlässigen mTOR-Inhibitors RapaLink-1 und des gehirnundurchlässigen FKBP12-Liganden RapaBlock. Wir zeigen, dass diese Arzneimittelkombination die systemischen Wirkungen von mTOR-Inhibitoren abschwächt, aber die Wirksamkeit von RapaLink-1 bei Glioblastom-Xenotransplantaten beibehält. Darüber hinaus stellen wir eine allgemeine Methode zum Entwurf zelldurchlässiger, FKBP12-abhängiger Kinaseinhibitoren aus bekannten Arzneimittelgerüsten vor. Diese Inhibitoren reagieren empfindlich auf die Deaktivierung durch RapaBlock und ermöglichen so eine hirnbeschränkte Hemmung ihrer jeweiligen Kinaseziele.

Die Verabreichung eines niedermolekularen Arzneimittels führt häufig zu systemischen pharmakologischen Wirkungen, die sowohl zur Wirksamkeit als auch zur Toxizität beitragen und dessen therapeutische Breite bestimmen. Obwohl Off-Target-Effekte durch chemische Modifikationen, die die Spezifität des Arzneimittels verbessern, abgemildert werden können, stellt die On-Target-Off-Gewebe-Toxizität eine einzigartige Herausforderung dar, die eine präzise Kontrolle der Gewebeverteilung erfordert. On-Target-Off-Gewebe-Toxizitäten betreffen häufig verwendete Medikamente wie Statine (Myopathie, die durch Hemmung der HMG-CoA-Reduktase im Skelettmuskel verursacht wird)1 und Antihistaminika der ersten Generation (Schläfrigkeit, die durch Blockade des H1-Rezeptors im Gehirn verursacht wird)2 und können schließen manchmal die sichere Verwendung ansonsten wirksamer Therapeutika aus. Ein Beispiel dafür sind chemische Inhibitoren von mTOR. Obwohl sowohl allosterische als auch orthosterische mTOR-Inhibitoren bei zahlreichen Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS) untersucht wurden, darunter Tuberkulose-Komplex3,4,5, Glioblastom6,7,8,9 und Alkoholkonsumstörung10,11,12, systemische Hemmung von mTOR ist mit verschiedenen dosislimitierenden Nebenwirkungen verbunden: Immunsuppression, Stoffwechselstörungen und Wachstumshemmung bei Kindern13,14. Wenn die pharmakologischen Wirkungen dieser mTOR-Inhibitoren auf das ZNS beschränkt werden könnten, könnte ihr therapeutisches Fenster erheblich erweitert werden. Hier stellen wir eine chemische Strategie vor, die eine gehirnspezifische mTOR-Hemmung durch die Kombination von zwei pharmakologischen Wirkstoffen ermöglicht: einem gehirndurchlässigen mTOR-Inhibitor (RapaLink-1), dessen Funktion das intrazelluläre Protein FK506-bindendes Protein 12 (FKBP12) erfordert, und einem Gehirn -impermeanter Ligand von FKBP12 (RapaBlock). Bei Verwendung in einem Glioblastom-Xenotransplantatmodell führte diese Arzneimittelkombination zu einer Tumorregression ohne erkennbare systemische Toxizität. Wir zeigen außerdem, dass diese Strategie angepasst werden kann, um eine gehirnspezifische Hemmung anderer Kinaseziele zu erreichen, indem wir eine Methode entwickeln, um bekannte Kinaseinhibitoren in FKBP12-abhängige Formate umzuwandeln.

Das therapeutische Targeting der mTOR-Kinase kann sowohl allosterisch als auch orthosterisch erreicht werden. Die mTOR-Inhibitoren der ersten Generation, Rapamycin und seine Analoga (Rapaloge), binden als Komplex mit dem intrazellulären Protein FKBP12 an die Rapamycin-bindende Domäne (FRB) FK506 von mTOR, was zu einer substratabhängigen allosterischen Hemmung des mTOR-Komplexes 1 führt (Lit. 15). ,16,17). mTOR-Kinaseinhibitoren der zweiten Generation (TORKi) binden direkt in die ATP-Tasche von mTOR und hemmen die Aktivität von mTOR-Komplex 1 und Komplex 2 (Ref. 18,19,20). Der mTOR-Inhibitor RapaLink-1 der dritten Generation ist ein bitopischer Ligand, der gleichzeitig die ATP-Tasche und eine allosterische Tasche (die FRB-Domäne) von mTOR angreift und so eine wirksame und dauerhafte Hemmung seiner Kinaseaktivität21 erreicht. Trotz seines hohen Molekulargewichts (1.784 Da) ist RapaLink-1 zell- und gehirnpermeant und hat im Vergleich zu früheren mTOR-Inhibitoren eine verbesserte In-vivo-Wirksamkeit bei der Förderung der Glioblastom-Regression gezeigt7.

Da RapaLink-1 einen TOR-Kinase-Inhibitor (TORKi)-Anteil enthält (Abb. 1a, graue Schattierung), der in der ATP-Tasche bindet, haben wir uns gefragt, ob die Wechselwirkung von RapaLink-1 mit FKBP12 für die Hemmung von mTOR wesentlich ist. Wir führten In-vitro-Kinasetests mit gereinigtem mTOR-Protein durch und stellten fest, dass RapaLink-1 identische Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) wie MLN0128 (der TORKi-Teil von RapaLink-1) aufwies, unabhängig davon, ob FKBP12 vorhanden war (Abb. 1b), was darauf hinweist RapaLink-1 kann das aktive Zentrum von mTOR unabhängig von FKBP12 in einer zellfreien Umgebung aktivieren. Als wir RapaLink-1 jedoch in Zellen testeten, beobachteten wir eine starke Abhängigkeit von FKBP12 für die mTOR-Hemmung. In K562-Zellen, die dCas9-KRAB exprimieren, beeinträchtigte der CRISPRi-vermittelte Abbau des für FKBP12 kodierenden Gens mit zwei unterschiedlichen Single Guide RNAs (sgRNAs) dessen zelluläre Aktivität drastisch (Abb. 1c). Dieser Effekt war noch ausgeprägter, als wir FK506 (einen hochaffinen natürlichen Liganden von FKBP12) verwendeten, um die Ligandenbindungsstelle von FKBP12 pharmakologisch zu blockieren. Eine ähnliche FKBP12-Abhängigkeit von RapaLink-1 wurde beobachtet, als wir die mTOR-Signalübertragung mittels Western Blot überwachten (Abb. 1d; siehe auch Lit. 21). Während 10 nM RapaLink-1 Phospho-S6 (S240/244) und Phospho-4EBP (T37/46) auf nahezu nicht nachweisbare Werte reduzierte, zeigte die Kombination von 10 nM RapaLink-1 und 10 µM FK506 keine Wirkung auf einen der beiden Marker.

a, Chemische Strukturen von RapaLink-1 und FK506. b, Hemmung der mTOR-Aktivität durch MLN128, RapaLink-1 oder Rapamycin in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 µM FKBP12 im In-vitro-Kinase-Assay (n = 2; Daten werden als einzelne Punkte dargestellt). c: K562-CRISPRi-Zellen, die mit sgRNAs transduziert wurden, die auf GAL4-4 (Kontrolle) oder FKBP12 abzielen, wurden mit RapaLink-1 behandelt und die Zellproliferation wurde nach 72 Stunden bewertet. In der zuletzt aufgeführten Bedingung wurden die Zellen mit sgRNA transduziert, aber mit RapaLink-1 in Gegenwart von 10 µM FK506 (n = 3) behandelt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung d dargestellt, Immunoblot-Analyse der mTOR-Signalübertragung in MCF7-Zellen, die mit DMSO, RapaLink-1, FK506 oder einer Kombination aus RapaLink-1 und FK506 behandelt wurden. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Aktin war die Ladekontrolle. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1. MW, Molekulargewicht. e, Schematische Darstellung des vorgeschlagenen Arbeitsmodells. Die grauen Kreise zeigen Zellmembranen an.

Quelldaten

Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass FKBP12 zwar für die Bindung und Hemmung des aktiven Zentrums von mTOR in vitro durch RapaLink-1 nicht unbedingt erforderlich ist, für die zelluläre Aktivität jedoch erforderlich ist und wahrscheinlich als intrazelluläre Senke für die Akkumulation von RapaLink-1 in der Zelle dient. Wir haben diese Möglichkeit anhand eines Strukturanalogs von RapaLink-1 untersucht, bei dem die TORKi-Einheit durch Tetramethylrhodamin ersetzt wurde (RapaTAMRA; Extended Data Abb. 1). Dieses fluoreszierende Analogon von RapaLink-1 ermöglichte uns die Quantifizierung der intrazellulären Verbindungskonzentration mittels Durchflusszytometrie. In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen zu RapaLink-1 (Lit. 21) und anderen FKBP-bindenden Verbindungen22,23 zeigte RapaTAMRA auch nach umfangreichem Auswaschen eine hohe Zellretention (zehnfacher Anstieg der mittleren Fluoreszenzintensität), dieser Effekt wurde jedoch durch den Abbau des Gens verringert Kodierung FKBP12 (Extended Data Abb. 1c). Auch wenn andere Faktoren dazu beitragen können, deuten unsere Daten darauf hin, dass die FKBP12-vermittelte Zellteilung eine große Rolle für die außergewöhnliche Wirksamkeit von RapaLink-1 spielt.

Als nächstes überlegten wir, ob die Abhängigkeit von RapaLink-1 von FKBP12 genutzt werden könnte, um eine ZNS-beschränkte mTOR-Hemmung zu erreichen. Insbesondere würde die selektive Blockade von FKBP12 in peripheren Geweben mit einem wirksamen, hirnundurchdringlichen niedermolekularen Liganden die Akkumulation von RapaLink im Gehirn, aber nicht in peripheren Geweben ermöglichen, was zu einer hirnspezifischen Hemmung führen würde (Abb. 2a). Um einen FKBP12-Ligandenkandidaten mit dem geeigneten Permeabilitätsprofil (d. h. zelldurchlässig, aber Blut-Hirn-Schranke (BBB) undurchlässig) zu identifizieren, haben wir bekannte natürliche und synthetische FKBP12-Liganden mit hoher Affinität in Betracht gezogen (z. B. FK506 (Lit. 24, 25). ), Rapamycin26,27 und SLF/Shield-1 (Ref. 28,29)), aber alle diese Verbindungen passieren leicht die BHS. Daher haben wir eine Reihe von Derivaten von SLF und FK506 synthetisiert, in denen polare Substituenten (insbesondere Wasserstoffbrückendonatoren und -akzeptoren) an die lösungsmittelexponierten Teile dieser beiden Moleküle gebunden waren, was den empirischen Regeln für die Entwicklung von BHS-durchlässigen Arzneimitteln direkt widerspricht30, 31 (Erweiterte Daten Abb. 2). Darüber hinaus hat die Modifikation des C21-Allyls von FK506 den zusätzlichen Vorteil, dass sie die Bindung an Calcineurin32, das natürliche Ziel von FK506, aufhebt, dessen Hemmung eine Unterdrückung der Signalübertragung des Kernfaktors aktivierter T-Zellen (NFAT) und damit eine Immunsuppression bewirkt (Abb. 2b). . Die Mehrzahl der von uns synthetisierten Shield-1- und FK506-Derivate behielt eine starke FKBP12-Bindung bei (Extended Data Abb. 2), gemessen durch einen kompetitiven Fluoreszenzpolarisationstest33. Anschließend haben wir diese Verbindungen (10 µM) in einem zellbasierten Assay gescreent und bewertet, ob sie mTOR vor der Hemmung durch RapaLink-1 (10 nM) schützen können, indem wir den Phospho-S6-Spiegel mittels Western Blot überwacht haben. Obwohl einige der SLF-Derivate die Wirksamkeit von Rapamycin abschwächten (und den Phospho-S6-Spiegel retteten), konnten sie RapaLink-1 nicht blockieren (Erweiterte Daten, Abb. 2a). Unterdessen waren die meisten FK506-Analoga wirksam, wobei einige von ihnen RapaLink-1 vollständig daran hinderten, mTOR zu hemmen (Extended Data Abb. 2b). Dies ist wahrscheinlich auf die geringere Affinität von SLF-Derivaten als FKBP12 zurückzuführen, was mit unseren Computermodellierungsergebnissen übereinstimmt (Einzelheiten siehe Ergänzende Anmerkung 1). Wir haben vier Verbindungen mit unterschiedlichen Seitenketten-Chemotypen einem zusätzlichen In-vivo-Screening unterzogen, bei dem die mTOR-Signalisierung separat im Gehirn und im Skelettmuskelgewebe von Mäusen analysiert wurde, die mit einer Kombination aus RapaLink-1 und der Kandidatenverbindung (1 und 40 mg) behandelt wurden pro kg). Ein Pyridin-N-oxid-Derivat von FK506 (06-041) schützte periphere Gewebe vor RapaLink-1, ermöglichte jedoch eine starke Hemmung von mTOR im Gehirn (Extended Data Abb. 3). Wir haben daher diese Verbindung für weitere Untersuchungen ausgewählt und bezeichnen sie als „RapaBlock“ (Abb. 2c).

a, Vorgeschlagenes Modell zur Erzielung einer gehirnspezifischen mTOR-Hemmung durch die Kombination eines FKBP12-abhängigen mTOR-Inhibitors (RapaLink-1) und eines gehirnundurchlässigen FKBP12-Liganden (RapaBlock). b: FK506-FKBP12-Cokristallstruktur (PDB: 1FKJ), die zeigt, dass die C21-Allylgruppe dem Lösungsmittel ausgesetzt ist und ihre Modifikation zu einer Aufhebung der Calcineurin-Bindung führen kann. c, Chemische Struktur von RapaBlock. Der blau schattierte Bereich zeigt die FKBP12-bindende Einheit. Der violette Anteil zeigt die chemische Modifikation im Vergleich zu FK506 an. d, Konkurrenz-Fluoreszenzpolarisationsassay unter Verwendung von Fluorescein-markiertem Rapamycin als Tracerverbindung (n = 2; Daten werden als einzelne Punkte dargestellt). e, Jurkat-Zellen, die eine Luciferase unter der Kontrolle des NFAT-Transkriptionsreaktionselements exprimieren, wurden mit Phorbolmyristatacetat und Ionomycin in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Verbindungen stimuliert (n = 3; Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt).

Quelldaten

RapaBlock und FK506 binden mit vergleichbarer Affinität an FKBP12 (Abb. 2d; Hemmkonstante (Ki): 3,1 nM bzw. 1,7 nM), aber im Gegensatz zu FK506 zeigt RapaBlock keine Hemmaktivität für Calcineurin (Abb. 2e). In kultivierten Zellen beeinflusst RapaBlock die mTOR-Signalübertragung selbst nicht (bis zu 10 µM), schwächt jedoch die pharmakologischen Wirkungen von RapaLink-1 dosisabhängig ab (Abb. 3a). RapaBlock scheint Rapamycin wirksamer zu blockieren und stellt das Phospho-S6-Signal auf das gleiche Niveau wie unbehandelte Zellen bei einer Stöchiometrie von 100:1 wieder her (Abb. 3d). Die hohe Affinität von RapaBlock zu FKBP12 ist entscheidend für seine Blockierungsaktivität – ein strukturelles Analogon von RapaBlock mit 100-fach reduzierter Bindung an FKBP12 konnte die mTOR-Hemmung durch RapaLink-1 nicht aufheben (Extended Data Abb. 4).

a,d, MCF7-Zellen wurden 4 Stunden lang mit einer Kombination aus RapaLink-1 und RapaBlock (a) oder Rapamycin und RapaBlock (d) behandelt, dann wurde die Phosphorylierung von mTOR-Substraten durch Immunblotting analysiert. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Als Beladungskontrolle wurde GDPDH verwendet. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1. b, e: Menschliche PBMCs wurden mit Anti-CD3 und Anti-CD28 in Gegenwart unterschiedlicher Mengen von RapaLink-1 und RapaBlock (b) oder Rapamycin und RapaBlock (e) stimuliert. und die Zellproliferation wurde nach 120 Stunden gemessen (n = 3; Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt). c,f, Die Sekretion von IL-2 im Kulturüberstand von PBMCs, die mit Anti-CD3 und Anti-CD28 stimuliert und mit Rapalink-1 (c) oder Rapamycin (f) behandelt wurden, wurde durch Sandwich-ELISA quantifiziert (n = 3; Daten sind dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung).

Quelldaten

Aufgrund der wichtigen Rolle der mTOR-Signalübertragung bei der Förderung des Zellwachstums34 fragten wir, ob RapaBlock die durch RapaLink-1 vermittelte Unterdrückung der T-Zell-Proliferation in vitro verhindern kann. Wir stimulierten menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von RapaLink-1 und RapaBlock und beurteilten die Zellproliferation nach 5 Tagen. Während RapaLink-1 die Proliferation von PBMCs bei nanomolaren Konzentrationen wirksam hemmte, hob die Zugabe von RapaBlock diesen Effekt auf und verschob den IC50 um mehr als das Hundertfache (Abb. 3b). Wir beobachteten auch eine höhere kumulative IL-2-Freisetzung in Zellen, die gleichzeitig mit RapaLink-1 und RapaBlock behandelt wurden, als in Zellen, die nur mit RapaLink-1 behandelt wurden (Abb. 3c). In Übereinstimmung mit unserer Beobachtung der mTOR-Signalübertragung schien RapaBlock PBMCs wirksamer vor Rapamycin-vermittelter Wachstumshemmung zu schützen (Abb. 3e, f). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass RapaBlock durch die kompetitive Bindung an intrazelluläres FKBP12 RapaLink-1 und Rapamycin unfähig macht, mTOR zu hemmen.

Um zu untersuchen, ob die Kombination von RapaLink-1 und RapaBlock eine gehirnspezifische Hemmung von mTOR in vivo ermöglicht, behandelten wir gesunde BALB/cnu/nu-Mäuse mit RapaLink-1 (1 mg pro kg) oder einer Kombination von RapaLink-1 (1 mg). pro kg) und RapaBlock (40 mg pro kg) stimulierten die mTOR-Aktivität mit Insulin (250 mU) nach 4 Stunden oder 24 Stunden und analysierten präparierte Gewebe mittels Immunoblot (Abb. 4a und erweiterte Daten Abb. 5). Wenn RapaLink-1 als Einzelwirkstoff verwendet wurde, hemmte es die mTOR-Signalübertragung sowohl in der Skelettmuskulatur als auch im Gehirngewebe wirksam, was durch die verringerte Phosphorylierung von S6 und 4EBP1 deutlich wurde. Allerdings zeigte die Kombination von RapaLink-1 und RapaBlock bemerkenswerte gewebespezifische Effekte; Obwohl die mTOR-Aktivität im Gehirn in einem vergleichbaren Ausmaß gehemmt war wie bei Mäusen, die nur mit RapaLink-1 behandelt wurden, wurde die mTOR-Aktivität im Skelettmuskel nicht gehemmt. Diese Gewebespezifität hat es uns ermöglicht, die mTOR-Aktivität im Gehirn von Mäusen bei chronischen Behandlungen zu hemmen, ohne dass die üblichen zielgerichteten Nebenwirkungen von mTOR-Inhibitoren wie Körpergewichtsverlust, beeinträchtigter Glukosestoffwechsel und Lebertoxizität auftreten35.

a, Analyse der mTOR-Signalübertragung im gesamten Gehirn und Skelettmuskel von Mäusen nach einer Einzeldosis RapaLink-1 (1 mg pro kg), RapaBlock (40 mg pro kg) oder einer Kombination aus beiden. Quantifizierte Intensitäten werden unter jedem Immunoblot als Faltungszunahme im Vergleich zu Muskel oder Gehirn ohne Insulinstimulation angezeigt, normalisiert auf GAPDH (n = 3; Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt). Zu jedem Zeitpunkt wurden statistische Tests zwischen den Behandlungsgruppen RapaLink-1 und RapaLink-1 + RapaBlock durchgeführt (zweiseitiger, ungepaarter Student-t-Test). Für ein Tier aus jeder Gruppe werden Immunblot-Bilder gezeigt. Weitere Replikate finden Sie in den erweiterten Daten in Abb. 5. Alle Proben stammen aus demselben Experiment. Gele und Blots wurden parallel verarbeitet. GAPDH war die Ladekontrolle. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1. b: Mäuse (n = 7), die Luciferase-exprimierende orthotope Glioblastom-Xenotransplantate (U87MG) trugen, wurden alle 5 Tage intraperitoneal behandelt mit: (1) Vehikel; (2) RapaBlock (40 mg pro kg); (3) RapaLink-1 (1 mg pro kg); und (4) RapaLink-1 (1 mg pro kg) und RapaBlock (40 mg pro kg). Tumorgröße und Mausgewicht wurden alle 5 Tage mittels Biolumineszenz-Bildgebung überwacht. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Statistische Tests wurden für jede Behandlungsgruppe im Vergleich zur mit Vehikel behandelten Gruppe durchgeführt: zweiseitiger, ungepaarter Student-t-Test (Tumorgröße am Tag 20) und Log-Rank-Test (Überleben). c: Mäuse (n = 5), die Luciferase-exprimierende orthotope Glioblastom-Xenotransplantate (GBM43) trugen, wurden alle 5 Tage intraperitoneal behandelt mit: (1) Vehikel; (2) RapaBlock (60 mg pro kg); (3) RapaLink-1 (1,2 mg pro kg); und (4) RapaLink-1 (1,2 mg pro kg) und RapaBlock (60 mg pro kg). Tumorgröße und Mausgewicht wurden alle 3 Tage mittels Biolumineszenz-Bildgebung überwacht. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Tests wurden für jede Behandlungsgruppe im Vergleich zur mit Vehikel behandelten Gruppe durchgeführt: zweiseitiger, ungepaarter Student-t-Test (Tumorgröße am Tag 10) und Log-Rank-Test (Überleben). NS, nicht signifikant.

Quelldaten

RapaLink-1 hat sich in orthotopen Mausmodellen des Glioblastoms als wirksam erwiesen, die Hemmung von mTOR in der Peripherie trägt jedoch nicht zur Wirksamkeit bei. Wir fragten, ob unser Kombinationsschema, dem die Fähigkeit fehlt, die mTOR-Aktivität in peripheren Geweben zu hemmen, die Wirksamkeit von RapaLink-1 bei der Behandlung von Glioblastomen aufrechterhalten könnte. Wir etablierten orthotope intrakranielle Xenotransplantate von U87MG-Zellen, die Glühwürmchen-Luciferase exprimieren, in Nacktmäusen und behandelten diese Mäuse alle 5 Tage mit intraperitonealen Injektionen von RapaLink-1 (1 mg pro kg), RapaBlock (40 mg pro kg) oder einer Kombination aus beiden. Alle Behandlungen wurden gut vertragen und es wurden keine signifikanten Veränderungen des Körpergewichts beobachtet (Abb. 4b und erweiterte Daten Abb. 6a). RapaLink-1, sowohl als Einzelwirkstoff als auch in Kombination mit RapaBlock, unterdrückte das Tumorwachstum erheblich und verbesserte das Überleben, während RapaBlock allein auf beides keine signifikante Wirkung hatte. Als nächstes testeten wir unsere Behandlungsstrategie an Mäusen mit intrakraniellen Xenotransplantaten von GBM43, einem äußerst aggressiven, vom Patienten stammenden Glioblastommodell36. Obwohl keine der Bedingungen das schnelle Wachstum der Tumoren unterdrückte, brachte die Kombination von RapaLink-1 (1,2 mg pro kg) und RapaBlock (60 mg pro kg) einen Überlebensvorteil (Abb. 4c und Extended Data Abb. 6b).

Nachdem wir einen binären Therapieansatz zur Erzielung einer gehirnspezifischen Hemmung von mTOR etabliert hatten, fragten wir uns, ob die gleiche Strategie auf andere Medikamente übertragen werden könnte, für die eine gehirnbeschränkte Pharmakologie wünschenswert wäre. Eine entscheidende Herausforderung besteht darin, dass die „aktive“ Komponente (z. B. RapaLink-1) von der Verfügbarkeit von FKBP12 abhängig sein muss, damit dieser Ansatz verallgemeinerbar ist. Medikamente mit dieser Eigenschaft sind selten; Außer Rapamycin und FK506 sind, wenn überhaupt, nur wenige bekannt. Unsere frühere Untersuchung von RapaLink-1 (Abb. 1) und RapaTAMRA (Extended Data Abb. 1) führte uns zu der Hypothese, dass andere bifunktionale Moleküle, die aus einer FKBP12-bindenden Einheit und einer Kinase-Inhibitor-Einheit bestehen, bedingt aktiv und für die Modulation zugänglich sein könnten RapaBlock.

Wir haben unsere Hypothese zunächst mit GNE7915 getestet, einem wirksamen und spezifischen Inhibitor der Leucin-reichen Repeat-Kinase 2 (LRRK2), der sich in präklinischen Untersuchungen zur Behandlung der Parkinson-Krankheit befindet37. Da Gain-of-Function-Mutationen von LRRK2 stark mit erblichen und sporadischen Formen der Parkinson-Krankheit assoziiert sind, wurde die Hemmung der LRRK2-Kinase als mögliche Therapiestrategie verfolgt38,39. Jüngste Studien, die zeigen, dass die systemische LRRK2-Hemmung mit niedermolekularen Inhibitoren die zytoplasmatische Vakuolisierung von Typ-II-Pneumozyten induziert, deuten jedoch auf ein potenzielles Sicherheitsrisiko für diese Verbindungen hin40,41. Wir haben FK-GNE7915 synthetisiert, indem wir die Pharmakophore von FK506 und GNE7915 chemisch mit einer Piperazingruppe verknüpft haben (Abb. 5a). In In-vitro-LRRK2-Kinasetests war FK-GNE7915 ein schlechterer Inhibitor als GNE7915 (Abb. 5c; IC50 von 107 nM bzw. 3,0 nM), obwohl seine Aktivität durch die Einbeziehung von 10 µM FKBP12 in den Test verstärkt wurde (IC50 von 21 nM). ). In einem zellulären Assay, in dem wir die Phospho-LRRK2 (S935)-Spiegel als Marker für die LRRK2-Hemmung quantifizierten, war FK-GNE7915 jedoch um mehr als das Zehnfache wirksamer als die Ausgangsverbindung GNE7915 (Abb. 5d; IC50 von 6,7 nM und 81). nM). Die Gegenüberstellung dieser beiden Ergebnisse deutete auf eine Rolle der FK506-Einheit bei der erhöhten zellulären Wirksamkeit von FK-GNE7915 hin. Wir kamen zu dem Schluss, dass die hochaffine FK506-FKBP12-Wechselwirkung die intrazelluläre Akkumulation von FK-GNE7915 ähnlich wie im Fall von RapaLink-1 fördern kann, und bestätigten dies mithilfe einer bifunktionalen Fluoreszenzsonde: FK-TAMRA (Extended Data Abb. 7). Mit dieser Funktion konnten wir die LRRK2-Hemmung programmieren, indem wir die Verfügbarkeit von FKBP12 kontrollierten. Während die Behandlung mit 100 nM FK-GNE7915 den Phospho-LRRK2-Spiegel (S935) auf 15 % des Grundspiegels senkte, hatte die Kombination von 100 nM FK-GNE7915 und 1 µM RapaBlock keinen Einfluss auf die LRRK2-Aktivität (Abb. 5e).

a, Strukturen von GNE7915 und FK-GNE7915. b, Vorgeschlagenes Arbeitsmodell für FKBP-abhängige Kinaseinhibitoren. c, Kinasehemmung in Abwesenheit oder Anwesenheit von ergänztem 10 µM rekombinantem FKBP12-Protein (n = 2; Daten werden als einzelne Punkte angezeigt). d,e, RAW264.7-Zellen wurden mit GNE7915, FK-GNE7915 und/oder RapaBlock behandelt und Phospho-LRRK2 (S935) wurde durch zeitaufgelösten FRET unter Verwendung epitopisch orthogonaler Antikörper für LRRK2 und p-LRRK2 (S935) analysiert (n = 3; Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Einzelheiten zum Experiment finden Sie in den Zusatzinformationen.

Quelldaten

Die erfolgreiche Umwandlung von GNE7915 in einen FKBP-abhängigen LRRK2-Inhibitor durch einfache Verknüpfung mit einem FK506-Fragment veranlasste uns, die Allgemeingültigkeit dieser Strategie zu bewerten. Wir haben mehrere Kinaseinhibitoren untersucht, die bei ZNS-Erkrankungen untersucht werden: Dasatinib (Src-Familienkinaseinhibitor für Glioblastome)42,43, Lapatinib (EGFR/HER2-Inhibitor für Glioblastome)44,45 und Prostetin (MAP4K4-Inhibitor für Amyotrophe Lateralsklerose und Alzheimer-Krankheit). )46. In allen drei Fällen führte die chemische Verknüpfung des Kinase-Inhibitors mit FK506 zu bifunktionellen Molekülen, die die Kinase-inhibitorischen Aktivitäten der Elternmoleküle beibehielten (Extended Data Abb. 8–10). Für FK-Dasatinib untersuchten wir auch seine Zielspezifität sowohl mithilfe von biochemischen (Invitrogen SelectScreen Kinase Profiling; Ergänzungstabelle 1) als auch Live-Cell-Kinase-Profiling47. Unter den gemeldeten Zielen von Dasatinib wurden Kinasen der Src-Familie sowohl durch Dasatinib als auch durch FK-Dasatinib wirksam gehemmt, wohingegen einige Tyrosinkinasen (z. B. DDR2) eine unterschiedliche Anfälligkeit für diese beiden Inhibitoren zeigten (Extended Data Abb. 8c). Trotz ihrer großen Molekulargewichte waren diese bifunktionellen Moleküle in Zellen mit vergleichbarer Wirksamkeit wie ihre Ausgangsverbindungen aktiv und reagierten empfindlich auf eine Deaktivierung durch RapaBlock. Obwohl diese Beispiele eine begrenzte Anzahl von Kinaseinhibitoren mit potenziellen Indikationen für ZNS-Erkrankungen darstellen, ist es denkbar, dass weitere Medikamente mit programmierbarer Pharmakologie ähnlich konfiguriert werden können, ohne dass die zelluläre Wirksamkeit verloren geht.

Durch Ausnutzung der einzigartigen funktionellen Abhängigkeit von Rapamycin-Analoga von FKBP12 haben wir einen Ansatz entwickelt, um eine gehirnspezifische mTOR-Hemmung durch die gleichzeitige Verabreichung eines wirksamen mTOR-Inhibitors (RapaLink-1) und eines zelldurchlässigen, BHS-undurchlässigen Liganden von FKBP12 zu erreichen (RapaBlock). Die durch diese Strategie der binären Pharmakologie ermöglichte gewebebeschränkte mTOR-Hemmung reduzierte die Toxizität in peripheren Geweben, behielt jedoch die therapeutischen Vorteile von RapaLink-1 in Glioblastom-Xenotransplantatmodellen bei. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse erscheint es vernünftig anzunehmen, dass dieselbe Arzneimittelkombination bei anderen ZNS-Erkrankungen, die durch eine fehlregulierte mTOR-Aktivität verursacht werden, wie z. B. einer Alkoholkonsumstörung, von größerem Wert sein könnte35.

Die Anwendbarkeit unseres Ansatzes geht über die mTOR-Hemmung hinaus. Wir zeigen, dass die chemische Verknüpfung von ATP-Site-Kinase-Inhibitoren mit FK506 über lösungsmittelexponierte Gruppen zu einer neuen Klasse zellpermeabler Kinase-Inhibitoren führt, deren Aktivität vom reichlich vorhandenen endogenen Protein FKBP12 abhängt. Diese Inhibitoren zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, die Bildung eines ternären Komplexes aus dem Arzneimittel, der Zielkinase und FKBP12 zu vermitteln, sowie durch ihre Fähigkeit zur Aktivitätsmodulation durch RapaBlock. Weitere In-vivo-Studien und medizinische Chemie sind erforderlich, um diese Verbindungen im Einzelfall zu bewerten und zu optimieren. Unsere ersten Untersuchungen zeigen jedoch, dass es möglich ist, eine gehirnselektive Kinasehemmung von LRRK2 mithilfe eines FKBP-abhängigen Kinaseinhibitors zu erreichen ( FK-GNE7915) und RapaBlock.

Wir haben den Mechanismus untersucht, durch den RapaBlock die zelluläre Aktivität von RapaLink-1 sowie anderen FKBP12-abhängigen Kinaseinhibitoren steuert. Unsere aktuellen Daten haben gezeigt, dass zelluläres FKBP12 mindestens zwei Rollen bei der Funktion von RapaLink-1 (und anderen FKBP12-bindenden Verbindungen) spielt. Erstens haben wir gezeigt, dass FKBP12 als Reservoir dient, um RapaLink-1 in der Zelle zurückzuhalten und anzusammeln, wodurch eine außergewöhnliche zelluläre Konzentration erreicht wird. Zweitens verbessert FKBP12 bei den meisten von uns untersuchten FKBP12-abhängigen Kinaseinhibitoren deren Wirksamkeit in zellfreien Tests. Obwohl wir keine direkten Beweise erhalten haben, gehen wir davon aus, dass in wässrigen Lösungen eine bifunktionelle Verbindung, die aus flexiblen Linkern zwischen hydrophoben Pharmakophoren aufgebaut ist, hauptsächlich eine bindungsinkompetente Konformation annimmt, um die Hydratationsnachteile zu minimieren („hydrophober Kollaps“) und die Bindung von FKBP12 freigelegt wird die Inhibitoreinheit, um die Zielhemmung zu ermöglichen. RapaBlock behindert beide Prozesse, indem es die Ligandenbindungsstelle von FKBP12 besetzt. Obwohl weitere Untersuchungen eindeutig erforderlich sind, um zu klären, wie diese hochmolekularen Verbindungen in Zellen gelangen und ob FKBP12 an der Bindungsinteraktion mit dem Zielprotein beteiligt ist, glauben wir, dass dieses System einen verallgemeinerbaren Ansatz für die programmierbare Kinasehemmung bietet.

Die Kombination zweier pharmazeutischer Wirkstoffe zur Erzielung gewebeselektiver therapeutischer Wirkungen wurde bereits in Arzneimitteln eingesetzt, die für den klinischen Einsatz zugelassen sind oder sich in der Entwicklung befinden. Beispiele hierfür sind Levodopa-Carbidopa (BBB-durchlässiger Dopamin-Vorläufer – BHS-undurchlässiger DOPA-Decarboxylase-Inhibitor) für die Parkinson-Krankheit48, konjugierte Östrogene – Bazedoxifen (BBB-durchlässiges Östrogen – BHS-undurchlässiger Östrogenrezeptor-Modulator) für postmenopausale Hitzewallungen und Osteoporose49 und Donepezil–Solifenacin (BBB-permeabler Acetylcholinesterase-Hemmer–BBB-undurchlässiges Anticholinergikum) bei Alzheimer-Krankheit50. Unser Ansatz unterscheidet sich von diesen Präzedenzfällen dadurch, dass er nicht zwei Medikamente mit gegensätzlicher Wirkung auf dasselbe Ziel oder denselben Signalweg umfasst; Stattdessen kontrolliert RapaBlock die Gewebespezifität, indem es die Aktivität des Kinaseinhibitors direkt abschwächt. Das vorliegende System hat daher den Vorteil, dass es für eine Vielzahl von Zielen anpassbar ist und lediglich ein invariantes RapaBlock-Molekül und einen FKBP12-abhängigen Inhibitor erfordert, der auf der Grundlage der Strukturen von FK506 und Leitverbindungen leicht entworfen werden kann. Obwohl wir uns in dieser Studie auf Proteinkinasen konzentriert haben, kann man davon ausgehen, dass der Ansatz auch auf andere Klassen therapeutischer Ziele anwendbar ist, wie etwa GTPasen und Histonmodifikationsenzyme.

DNA-Sequenzen, die für menschliches FKBP12 voller Länge kodieren, wurden von Twist Biosciences synthetisiert und unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie in den pET47b-Vektor kloniert. Die Proteinexpression wurde im Escherichia coli-Stamm BL21(DE3) durchgeführt. Kurz gesagt, chemisch kompetente BL21(DE3)-Zellen wurden mit pET47b-FKBP12 transformiert und auf LB-Mediumplatten mit 50 µg ml–1 Kanamycin bei 37 °C gezüchtet. Eine einzelne Kolonie wurde verwendet, um eine Kultur bei 37 °C und 220 U/min in hervorragender Brühe mit 50 µg ml–1 Kanamycin zu inokulieren. Als die optische Dichte 0,6 erreichte, wurde die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG bis 1 mM induziert. Nach 2 Stunden bei 37 °C wurden die Zellen durch Zentrifugation (6.500 g für 10 Minuten) pelletiert und in Lysepuffer (20 mM Tris 8,0, 500 mM NaCl und 5 mM Imidazol) mit einem Hochdruckhomogenisator (Microfluidics) lysiert. Das Lysat wurde durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation (19.000 g für 15 Minuten) geklärt und der Überstand wurde für die anschließende Reinigung durch Affinitätschromatographie mit immobilisierten Metallen verwendet. His-markiertes FKBP12 wurde durch einstündige Inkubation mit Co-TALON-Harz (Clonetech, Takara Bio USA, 4 ml Aufschlämmung pro Liter Kultur) bei 4 °C und konstantem End-to-End-Mischen eingefangen. Die beladenen Perlen wurden dann mit Lysepuffer (50 ml l–1 Kultur) gewaschen und das Protein mit Elutionspuffer (20 mM Tris 8,0, 500 mM NaCl und 300 mM Imidazol) eluiert. Der His-Tag wurde mit His-Tag versehener HRV 3C-Protease (Clonetech, Takara Bio USA, 5 U l–1 Kultur) bei 4 °C gespalten, bis die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse des Reaktionsgemisches eine Spaltung von mehr als 95 % anzeigte. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem 10K MWCO-Zentrifugalkonzentrator (Amicon-15, Millipore) auf 20 mg ml–1 konzentriert und durch Größenausschlusschromatographie auf einer Superdex 75 10/300 GL-Säule (GE Healthcare Life Sciences) mit SEC-Puffer gereinigt ( 20 mM HEPES pH 7,5 und 150 mM NaCl). Fraktionen, die reines FKBP12-Protein enthielten, wurden gepoolt und auf 20 mg ml–1 konzentriert und bei –78 °C gelagert. Dieses Protokoll ergibt eine typische Ausbeute von 10–20 mg l–1 Kultur für FKBP12.

Die Bindungsaffinität der Verbindung wurde mithilfe eines kompetitiven Fluoreszenzpolarisationsassays bestimmt. Ein auf Rapamycin basierendes fluoreszierendes Tracermolekül (FITC-Rapa)33 wurde intern synthetisiert. Der Testpuffer war 20 mM HEPES pH 7,5 und 0,01 % Triton X-100. Die Dissoziationskonstante (Kd) des Tracermoleküls für FKBP12 wurde zunächst durch Messung der Fluoreszenzpolarisation (Anregung von 485 nm und Emission von 535 nm) bei verschiedenen Proteinkonzentrationen und Anpassung der Kurve an ein quadratisches Bindungsmodell bestimmt. Um die Bindungsaffinität der Verbindung zu messen, wurden Mischungen mit der folgenden Zusammensetzung doppelt in schwarzen undurchsichtigen 96-Well-Platten (Corning 3915) hergestellt: 0,5 nM FITC-Rapa, 1 nM FKBP12, 5 % DMSO und 5 µM bis 0,08 nM Testverbindung. 200 µl Gesamtvolumen. Die Fluoreszenzpolarisation wurde mit einem TECAN Spark 20M-Plattenlesegerät gemessen (Anregung 485 nm und Emission 535 nm). Die Daten wurden an eine Sigmoidkurve mit drei Parametern angepasst, um IC50-Werte abzuleiten. Ki der Verbindungen wurde mit einem vom Labor von S. Wang bereitgestellten Tool berechnet (http://www.umich.edu/~shaomengwanglab/software/calc_ki/index.html). Die Daten wurden in GraphPad Prism 9.0 aufgezeichnet.

MCF7-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC; HTB-22) erhalten und in 1:1 DMEM:F12 (Gibco) plus 10 % hitzeinaktiviertem FBS (Axenia Biologix), ergänzt mit 4 mM L-Glutamin, 100 U, gehalten ml–1 Penicillin und 100 E ml–1 Streptomycin (Gibco). SK-BR-3-Zellen wurden von der ATCC (HTB-30) erhalten und in McCoy's 5A (Gibco) plus 10 % hitzeinaktiviertem FBS, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U ml–1 Penicillin und 100 U ml–, gehalten. 1 Streptomycin (Gibco). K562 CRISPRi-Zellen waren ein Geschenk von L. Gilbert und wurden in RPMI 1640 (Gibco) plus 10 % hitzeinaktiviertem FBS, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U ml–1 Penicillin, 100 U ml–1 Streptomycin (Gibco) und gehalten 0,1 % Pluronic F-68 (Gibco). RAW264.7-Zellen wurden von der ATCC (TIB-71) erhalten und in DMEM (Gibco) plus 10 % hitzeinaktiviertem FBS, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U ml–1 Penicillin und 100 U ml–1 Streptomycin, gehalten ( Gibco). Jurkat-Zellen wurden von der ATCC (TIB-152) erhalten und in RPMI 1640 (Gibco) plus 10 % hitzeinaktiviertem FBS, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U ml–1 Penicillin und 100 U ml–1 Streptomycin (Gibco), gehalten ). Jurkat-Lucia-NFAT-Zellen wurden von InvivoGen erhalten und in IMDM (Gibco) plus 10 % hitzeinaktiviertem FBS, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U ml–1 Penicillin, 100 U ml–1 Streptomycin (Gibco) und 100 µg, gehalten ml–1 Zeocin (InvivoGen). HEK293T-Zellen wurden von der UCSF Cell Culture Facility erhalten und in 1:1 DMEM:F12 (Gibco) plus 10 % hitzeinaktiviertem FBS, ergänzt mit 4 mM L-Glutamin, 100 U ml–1 Penicillin und 100 U ml–1 Streptomycin, gehalten ( Gibco). Alle Zelllinien wurden mit dem MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza) auf Mykoplasmen negativ getestet. Bei den Zelllinien der ATCC handelte es sich um vom Hersteller profilierte Short Randem Repeat (STR). Jurkat-Lucia NFAT-Zellen sind eine kommerzielle Zelllinie, die von InvivoGen entwickelt und vom Hersteller authentifiziert wurde. Zelllinien der UCSF Cell Culture Facility wurden von der UCSF Cell Culture Facility einem STR-Profil unterzogen. Nach dem Kauf wurden keine weiteren Authentifizierungen durchgeführt. Wenn angezeigt, wurden die Zellen mit Arzneimitteln bei einer Konfluenz von 60–80 % und einer DMSO-Endkonzentration von 1 % behandelt. Am Ende des Behandlungszeitraums wurden die Zellen auf Eis gelegt und einmal mit PBS gewaschen. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Zellen mit einem Spatel abgekratzt, durch Zentrifugation (500 g für 5 Minuten) pelletiert und in RIPA-Puffer (25 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1 % NP-40 und 0,5 % Natriumdesoxycholat) lysiert ) ergänzt mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (cOmplete und phosSTOP, Roche) auf Eis für 10 Minuten. Die Lysate wurden durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation (19.000 g für 10 Minuten) geklärt. Die Konzentrationen der Lysate wurden mit einem Protein-BCA-Assay (Thermo Fisher) bestimmt und mit zusätzlichem RIPA-Puffer auf 2 mg ml–1 eingestellt. Die Proben wurden mit 5× SDS-Beladungsfarbstoff gemischt und 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt.

Sofern nicht anders angegeben, wurde die SDS-PAGE mit Novex 4–12 % Bis-Tris-Gel (Invitrogen) in MES-Laufpuffer (Invitrogen) bei 200 V 40 Minuten lang gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Proteinbanden wurden unter Verwendung eines Nasstank-Transfergeräts (Bio-Rad Criterion Blotter) in 1 × TOWBIN-Puffer mit 10 % Methanol bei 75 V für 45 Minuten auf 0,45-µm-Nitrozellulosemembranen (Bio-Rad) übertragen. Die Membranen wurden 1 Stunde lang bei 23 °C in 5 % BSA-TBST blockiert. Die primäre Antikörperbindung wurde mit den angegebenen Antikörpern, verdünnt in 5 % BSA-TBST, bei 4 °C für mindestens 16 Stunden durchgeführt. Nach dreimaligem Waschen der Membran mit TBST (5 Minuten für jeden Waschgang) wurden sekundäre Antikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-IRDye 800 und Ziegen-Anti-Maus-IgG-IRDye 680; Li-COR) als Lösungen in 5 % Magermilch zugegeben –TBST in den vom Hersteller empfohlenen Verdünnungen. Die sekundäre Antikörperbindung konnte 1 Stunde lang bei 23 °C erfolgen. Die Membran wurde dreimal mit TBST gewaschen (5 Minuten für jeden Waschgang) und auf einem Li-COR Odyssey Fluoreszenz-Imager abgebildet. Eine vollständige Liste der in dieser Studie verwendeten Antikörper finden Sie in der Ergänzungstabelle 2.

Jurkat-Lucia-NFAT-Zellen wurden auf 2 × 106 Zellen pro ml in frischem Wachstumsmedium resuspendiert und in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen (Corning 3904; 180 µl pro Vertiefung) verteilt. DMSO-Lösungen der Testverbindungen in der 100-fachen Testkonzentration wurden zugegeben und die Zellen wurden 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. In jede Vertiefung (20 µl pro Vertiefung) wurde eine 10-fache Stimulationslösung mit Phorbolmyristatacetat (100 ng ml–1) und Ionomycin (10 µg ml–1) gegeben, mit Ausnahme der Negativkontrollvertiefungen, die mit 20 µl Medium ergänzt wurden . Die Zellen wurden 12 Stunden lang bei 37 ° C inkubiert. Zellen (20 µl pro Vertiefung) wurden in eine weiße, undurchsichtige Platte mit 96 Vertiefungen (Corning 3912) überführt. Der mit einem automatischen Injektionssystem ausgestattete TECAN Spark 20M-Plattenleser wurde mit Lucia-Luciferase-Substratlösung vorbereitet und auf die folgenden Parameter eingestellt: 50 µl Injektionsvolumen, Endpunktmessung mit einer Verzögerungszeit von 4 s und einer Integrationszeit von 0,1 s. Die Luciferase-Aktivität wurde mit den oben genannten Einstellungen gemessen und auf DMSO-behandelte, stimulierte Zellen normalisiert. Die Daten wurden in GraphPad Prism 9.0 aufgezeichnet.

Jurkat-Zellen wurden wie im Abschnitt „Zellkultur“ beschrieben kultiviert und behandelt. Am Ende des Behandlungszeitraums wurden 1,5-ml-Aliquote der Zellen pelletiert (500 g für 5 Minuten) und einmal mit serumfreiem RPMI (1 ml) gewaschen. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen wurden in 100 µl 5 µg ml–1 OKT3 (Invitrogen; funktionelle Qualität) in RPMI resuspendiert und sofort in ein 37 °C warmes Wasserbad gegeben. Nach 5 Minuten wurden 25 µl 5×SDS-Ladepuffer hinzugefügt und schnell mit den Zellen vermischt. Die Probe wurde 60 s lang mit 30 % Leistung beschallt (1 s an, 1 s aus) mit dem Qsonica Q500 Sonicator, um die DNA zu scheren. Die Proben wurden 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt und für die SDS-PAGE verwendet.

Phospho-LRRK2 (S935) wurde in medikamentenbehandelten Zellen unter Verwendung eines Phospho-LRRK2 (Ser935)-Zellkits (Cisbio) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. RAW264.7-Zellen (2 × 10 Zellen pro ml) wurden 24 Stunden vor der Behandlung in Gewebekulturplatten mit sechs Vertiefungen (2 ml pro Vertiefung) ausplattiert. Die Zellen wurden 2 Stunden lang mit Verbindungen in den angegebenen Konzentrationen behandelt. Das Medium wurde durch Absaugen entfernt und die Zellen wurden mit eiskaltem PBS (1 ml) gespült. Die Zellen wurden mit 100 µl Cisbio 1X Lysepuffer bei 23 °C direkt in der Platte 30 Minuten lang lysiert. Die Lysate wurden in Mikrozentrifugenröhrchen überführt und durch Zentrifugation (19.000 g für 10 Minuten) geklärt. Geklärtes Lysat (16 µl) wurde in eine Vertiefung einer 384-Well-Platte mit geringem Volumen und rundem Boden gegeben, und in jede Vertiefung wurden 4 µl LRRK2-Phospho-LRRK2 (S935)-Antikörper-Mastermix (Cisbio) gegeben. Die Platte wurde 4 Stunden lang bei 23 °C inkubiert. Die zeitaufgelöste Fluoreszenz wurde auf einem TECAN Spark 20M-Plattenlesegerät mit den folgenden Parametern abgelesen: Verzögerungszeit von 60 µs; Integrationszeit von 500 µs; Lesen Sie A, einschließlich Anregungsfilter von 320 (25) nm, Emissionsfilter von 610 (25) nm und Verstärkung von 130; Read B umfasste einen Anregungsfilter von 320 (25) nm, einen Emissionsfilter von 665 (8) nm und eine Verstärkung von 165.

Das TR-FRET-Signal wurde als Verhältnis der Fluoreszenzintensität [read B]/[read A] berechnet. Die Daten wurden in GraphPad Prism 9.0 aufgezeichnet.

HEK293T-Zellen wurden mit Standard-Verpackungsvektoren unter Verwendung des TransIT-LT1-Transfektionsreagenzes (Mirus Bio) transfiziert. Der Virusüberstand wurde 2–3 Tage nach der Transfektion gesammelt, durch 0,45 μm Polyvinylidendifluoridfilter (Millipore Sigma) filtriert und vor der Transduktion bei –80 °C eingefroren.

sgRNA-Protospacer, die auf GAL4-4 (Negativkontrolle sg GAACGACTAGTTAGGCGTGTA) und FKBP12 (FKBP12 sg1 GACGGCTCTGCCTAGTACCT und FKBP12 sg2 GCCCAGGAGACGGTGAGTAG)51 abzielen, wurden in pCRISPRia-v2 (markiert mit einer Puromycin-Resistenzkassette und BFP; Addgen #84832) kloniert. Kurz gesagt, komplementäre synthetische Oligonukleotide (Integrated DNA Technologies) mit flankierenden BstXI- und BlpI-Restriktionsstellen wurden mit BstXI- und BlpI-verdautem pCRISPRia-v2 angelagert und ligiert. Die sgRNA-Expressionsvektoren wurden wie oben beschrieben in Lentivirus verpackt. Knockdown-Zellen wurden durch Transduktion von K562 CRISPRi (sgRNA–)-Zellen mit den sgRNA-Expressionsvektoren bei einer Infektionsmultiplizität von weniger als 1 (20–40 % Transduktionsrate) mit 8 μg ml–1 Polybren erzeugt. Beginnend am zweiten Tag nach der lentiviralen Zugabe wurden transduzierte (sgRNA+) Zellen unter Verwendung von 2 μg ml–1 Puromycin (Gibco) selektiert, bis jede Zellpopulation stabil 95 % oder mehr BFP+ erreichte (405-nm-Anregungslaser und 440/50-nm-Emission). Filter) durch Durchflusszytometrie auf einem Attune NxT (Thermo Fisher Scientific).

Die Zellen wurden in weiße Platten mit flachem Boden und 96 Vertiefungen (1.000 Zellen pro Vertiefung) (Corning) ausgesät und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden mit den angegebenen Verbindungen in einer neunfachen Dreifachverdünnungsreihe (100 μl Endvolumen) behandelt und 72 Stunden lang inkubiert. Unter bestimmten Bedingungen wurden 10 μM FK506 gleichmäßig zur Verdünnungsreihe hinzugefügt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mithilfe eines kommerziellen CellTiter-Glo (CTG)-Lumineszenztests (Promega) bewertet. Kurz gesagt, die 96-Well-Platten wurden vor der Zugabe von verdünntem CTG-Reagenz (100 μl) (1:4 CTG-Reagenz:PBS) auf Raumtemperatur äquilibriert. Die Platten wurden 30 Minuten lang auf einen Orbitalschüttler gelegt, bevor die Lumineszenz mit einem Plattenlesegerät Spark 20M (TECAN) aufgezeichnet wurde. Die Daten wurden in GraphPad Prism 9.0 aufgezeichnet.

Nicht transduzierte (kein Virus oder sgRNA–) und sgRNA-Expressionsvektor-transduzierte (sgRNA+) K562-CRISPRi-Zellen wurden im Verhältnis 1:1 gemischt, in Platten mit 48 Vertiefungen ausplattiert und über Nacht inkubiert. Zellmischungen wurden mit den angegebenen TAMRA-verknüpften Verbindungen (300 μl Endvolumen) behandelt und 24 Stunden lang inkubiert. Die Platten wurden auf Eis gelegt und 200 μl jeder Verbindung-Zell-Mischung wurden auf eine U-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen übertragen. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 500 g pelletiert und anschließend zweimal mit eiskaltem FACS-Puffer (PBS + 1 % BSA + 0,1 % NaN3) gewaschen. Die Zellen wurden in 200 μl eiskaltem FACS-Puffer resuspendiert und mit einem Attune NxT (Thermo Fisher Scientific) bewertet. Die relative Aufnahme von TAMRA-gebundenen Verbindungen wurde durch Vergleich der TAMRA-Fluoreszenz (561-nm-Anregungslaser und 585/16-nm-Emissionsfilter) zwischen sgRNA- und sgRNA+-Zellen in jeder Vertiefung bestimmt.

In-vitro-Kinasehemmungstests wurden von SelectScreen Services (Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung des Testformats Z'-LYTE (mTOR, Src, Csk, EGFR, HER2 und HGK), Adapta (LRRK2) oder LanthaScreen (DDR2) durchgeführt (standardisierte Protokolle können). Der Zugriff erfolgt auf der Website von SelectScreen: https://www.thermofisher.com/us/en/home/products-and-services/services/custom-services/screening-and-profiling-services/selectscreen-profiling-service/selectscreen -kinase-profiling-service.html. Wenn angegeben, wurde rekombinantes FKBP12-Protein der Testmischung bis zu einer Endkonzentration von 10 µM zugesetzt.

Alle Tierversuche wurden unter Verwendung von Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California, San Francisco, genehmigt wurden. Für In-vivo-Experimente wurden weibliche athymische BALB/Cnu/nu-Nacktmäuse (4–6 Wochen alt) verwendet. Alle Mäuse am Helen Diller Cancer Center UCSF wurden in individuell belüfteten Mikroisolatorkäfigen gehalten. Die Gehäusegestelle verfügten über automatisches Wasser, das durch Filtration, Umkehrosmose und UV-Lichteinwirkung sterilisiert wurde. Alle Mäuse erhielten eine vorbestrahlte Standardnahrung. Der Hell-Dunkel-Zyklus betrug 12 Stunden hell–12 Stunden dunkel. Die Temperatur wurde im Bereich von 68–74 °F gehalten. Die Luftfeuchtigkeit wurde bei 30–70 % gehalten. Für die Western-Blot-Analyse der mTOR-Signalübertragung wurden 4–6 Wochen alte weibliche athymische BALB/Cnu/nu-Mäuse (drei pro Gruppe; randomisiert) verwendet, die mit intraperitonealen Injektionen von Vehikel (20 % DMSO, 40 % PEG-300 und 40 % PEG-300) behandelt wurden. PBS (v/v)), RapaLink-1 (1 mg pro kg), RapaBlock (40 mg pro kg) und eine Kombination aus RapaLink-1 (1 mg pro kg) und RapaBlock (40 mg pro kg) für 15 Minuten , gefolgt von einer intraperitonealen Injektion von 250 mU Insulin oder Kochsalzlösung, dann 15 Minuten später eingeschläfert. Skelettmuskel und Gehirn jeder Maus wurden lysiert und mittels Western Blot analysiert. Für orthotopische Injektionen und Behandlungsstudien wurden weibliche BALB/Cnu/nu-Mäuse (4–6 Wochen alt) mit Isofluran anästhesiert. U87MG-Zellen (3 × 105), die Glühwürmchen-Luciferase exprimieren, wurden intrakraniell (Hamilton-Spritze) an Koordinaten 2 mm anterior und 1,5 mm lateral der rechten Hemisphäre relativ zu Bregma in einer Tiefe von 3 mm injiziert. Bei jeder Maus wurde alle 5 Tage die Biolumineszenz des gesamten Gehirns gemessen. Als die Biolumineszenz 106 Photonen pro Sekunde erreichte, wurden die Mäuse randomisiert in vier Gruppen mit gleichem mittleren Biolumineszenzsignal eingeteilt (sieben Mäuse pro Gruppe) und die Therapie wurde eingeleitet. Die Gruppen wurden mit intraperitonealer Injektion von Vehikel (20 % DMSO, 40 % PEG-300 und 40 % PBS (v/v)), RapaLink-1 (1,0 mg pro kg), RapaBlock (40 mg pro kg) oder einer Kombination behandelt von RapaLink-1 (1,0 mg pro kg) und RapaBlock (40 mg pro kg) alle 5 Tage für 25–30 Tage. Mäuse wurden täglich überwacht und eingeschläfert, wenn sie neurologische Defizite oder einen Rückgang des ursprünglichen Körpergewichts um 15 % aufwiesen. Für GBM43-Xenotransplantatstudien wurden GBM43-Zellen (1 × 105), die Glühwürmchen-Luciferase exprimierten, intrakraniell (Hamilton-Spritze) an Koordinaten 2 mm vor und 1,5 mm lateral der rechten Hemisphäre relativ zu Bregma in einer Tiefe von 3 mm injiziert. Bei jeder Maus wurde alle 5 Tage die Biolumineszenz des gesamten Gehirns gemessen. Als die Biolumineszenz 106 Photonen pro Sekunde erreichte, wurden die Mäuse randomisiert in vier Gruppen mit gleichem mittleren Biolumineszenzsignal eingeteilt (fünf Mäuse pro Gruppe) und die Therapie wurde eingeleitet. Die Gruppen wurden mit intraperitonealer Injektion von Vehikel (20 % DMSO, 40 % PEG-300 und 40 % PBS (v/v)), RapaLink-1 (1,2 mg pro kg), RapaBlock (60 mg pro kg) oder einer Kombination behandelt von RapaLink-1 (1,2 mg pro kg) und RapaBlock (60 mg pro kg) alle 5 Tage für 15–20 Tage. Mäuse wurden täglich überwacht und eingeschläfert, wenn sie neurologische Defizite oder einen Rückgang des ursprünglichen Körpergewichts um 15 % aufwiesen. Für die Abbildung der Luciferase-Aktivität und die Messung der Tumorlast waren die Forscher von der Gruppenzuordnung der Mäuse ausgeschlossen.

Einzelheiten zur chemischen Synthese und den 1H- und 13C-NMR-Spektren von RapaBlock finden Sie in den Ergänzenden Anmerkungen 2 und 3.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verlinkt ist.

Unverarbeitete Gelbilder für alle Immunblots (Abb. 1d, 3a, d und 4a und erweiterte Daten Abb. 3, 4c, 5, 8e, f und 9d) sind in der ergänzenden Abb. 1 dargestellt. Rohdaten für die Kinase-Hemmungstests, Zelle Wachstumstests und Xenotransplantatstudien stehen als Quelldatendateien zur Verfügung. Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Johnson, TE et al. Statine induzieren Apoptose in Myotube-Kulturen von Ratten und Menschen, indem sie die Geranylgeranylierung von Proteinen hemmen, nicht jedoch Ubichinon. Toxicol. Appl. Pharmakol. 200, 237–250 (2004).

CAS PubMed Google Scholar

Reiner, PB & Kamondi, A. Mechanismen der durch Antihistaminika induzierten Sedierung im menschlichen Gehirn: Die Aktivierung des H1-Rezeptors reduziert einen Hintergrundleckstrom von Kalium. Neuroscience 59, 579–588 (1994).

CAS PubMed Google Scholar

Li, M. et al. Wirksamkeit und Sicherheit von mTOR-Inhibitoren (Rapamycin und seine Analoga) bei Tuberkulose-Komplex: eine Metaanalyse. Orphanet J. Rare Dis. 14, 1–9 (2019).

Google Scholar

Franz, DN et al. Rapamycin verursacht eine Rückbildung von Astrozytomen im Tuberkulose-Komplex. Ann. Neurol. 59, 490–498 (2006).

CAS PubMed Google Scholar

Rageot, D. et al. Entdeckung und präklinische Charakterisierung von 5-[4,6-Bis({3-oxa-8-azabicyclo[3.2.1]octan-8-yl})-1,3,5-triazin-2-yl]-4- (Difluormethyl)pyridin-2-amin (PQR620), ein hochwirksamer und selektiver mTORC1/2-Inhibitor gegen Krebs und neurologische Erkrankungen. J. Med. Chem. 61, 10084–10105 (2018).

CAS PubMed Google Scholar

Akhavan, D., Cloughesy, TF & Mischel, PS Vom Labor bis zum Krankenbett gelernt. Neuro Oncol. 12, 882–889 (2010).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fan, QW et al. Ein gegen mTORC1 gerichteter Kinaseinhibitor treibt die Regression bei Glioblastomen voran. Krebszelle 31, 424–435 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lapointe, S. et al. Eine Phase-I-Studie zu Vistusertib (dualer mTORC1/2-Inhibitor) bei Patienten mit vorbehandeltem Glioblastoma multiforme: eine CCTG-Studie. Investieren. New Drugs 38, 1137–1144 (2020).

CAS PubMed Google Scholar

US-amerikanische Nationalbibliothek für Medizin. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04774952 (2022).

Neasta, J. et al. Rolle des Säugetierziels der Rapamycin-Komplex-1-Signalisierung bei Neuroadaptionen, die alkoholbedingten Störungen zugrunde liegen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 107, 20093–20098 (2010).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barak, S. et al. Eine Störung der alkoholbezogenen Erinnerungen durch mTORC1-Hemmung verhindert einen Rückfall. Nat. Neurosci. 16, 1111–1117 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morisot, N., Novotny, CJ, Shokat, KM & Ron, D. Eine neue Generation von mTORC1-Inhibitoren schwächt die Alkoholaufnahme und Belohnung bei Mäusen. Süchtig. Biol. 23, 713–722 (2018).

CAS PubMed Google Scholar

Pallet, N. & Legendre, C. Unerwünschte Ereignisse im Zusammenhang mit mTOR-Inhibitoren. Expertenmeinung. Arzneimittelsicherheit. 12, 177–186 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

González, D. et al. Wachstum nierentransplantierter pädiatrischer Patienten, die mit Sirolimus behandelt wurden. Pädiatr. Nephrol. 26, 961–966 (2011).

PubMed Google Scholar

Chiu, MI, Katz, H. & Berlin, V. RAPT1, ein Säugetierhomolog von Hefe Tor, interagiert mit dem FKBP12/Rapamycin-Komplex. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 91, 12574–12578 (1994).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Loewith, R. et al. Zwei TOR-Komplexe, von denen nur einer Rapamycin-empfindlich ist, spielen unterschiedliche Rollen bei der Kontrolle des Zellwachstums. Mol. Zelle 10, 457–468 (2002).

CAS PubMed Google Scholar

Gaubitz, C. et al. Molekulare Grundlagen der Rapamycin-Unempfindlichkeit des Ziels des Rapamycin-Komplexes 2. Mol. Zelle 58, 977–988 (2015).

CAS PubMed Google Scholar

Feldman, ME et al. Inhibitoren des aktiven Zentrums von mTOR zielen auf Rapamycin-resistente Ausgänge von mTORC1 und mTORC2 ab. PLoS Biol. 7, 0371-0383 (2009).

Google Scholar

García-Martínez, JM et al. Ku-0063794 ist ein spezifischer Inhibitor des Säugetierziels von Rapamycin (mTOR). Biochem. J. 421, 29–42 (2009).

PubMed Google Scholar

Thoreen, CC et al. Ein ATP-kompetitives Säugetierziel des Rapamycin-Inhibitors zeigt Rapamycin-resistente Funktionen von mTORC1. J. Biol. Chem. 284, 8023–8032 (2009).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rodrik-Outmezguine, VS et al. Überwindung von mTOR-Resistenzmutationen mit einem mTOR-Inhibitor der neuen Generation. Natur 534, 272–276 (2016).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marinec, PS et al. Das FK506-bindende Protein (FKBP) verteilt einen modifizierten HIV-Proteaseinhibitor in Blutzellen und verlängert dessen Lebensdauer in vivo. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 106, 1336–1341 (2009).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Orange, DE et al. Mit FK506 beladene dendritische Zellen töten T-Zellen auf antigenspezifische Weise und verhindern Autoimmunität in vivo. eLife 2, e00105 (2013).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, J. et al. Calcineurin ist ein häufiges Ziel von Cyclophilin-Cyclosporin-A- und FKBP-FK506-Komplexen. Zelle 66, 807–815 (1991).

CAS PubMed Google Scholar

Griffith, JP et al. Röntgenstruktur von Calcineurin, das durch den Immunophilin-Immunsuppressivum-Komplex FKBP12-FK506 gehemmt wird. Zelle 82, 507–522 (1995).

CAS PubMed Google Scholar

Brown, EJ et al. Ein Säugetierprotein, auf das der G1-hemmende Rapamycin-Rezeptor-Komplex abzielt. Nature 369, 756–758 (1994).

ADS CAS PubMed Google Scholar

Sabatini, DM, Erdjument-Bromage, H., Lui, M., Tempst, P. & Snyder, SH RAFT1: ein Säugetierprotein, das in Rapamycin-abhängiger Weise an FKBP12 bindet und homolog zu Hefe-TORs ist. Zelle 78, 35–43 (1994).

CAS PubMed Google Scholar

Holt, DA et al. Design, Synthese und kinetische Bewertung hochaffiner FKBP-Liganden. Marmelade. Chem. Soc. 115, 9925–9938 (1993).

CAS Google Scholar

Banaszynski, LA, Chen, LC, Maynard-Smith, LA, Ooi, AG & Wandless, TJ Eine schnelle, reversible und einstellbare Methode zur Regulierung der Proteinfunktion in lebenden Zellen mithilfe synthetischer kleiner Moleküle. Zelle 126, 995–1004 (2006).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pajouhesh, H. & Lenz, GR Medizinische chemische Eigenschaften erfolgreicher Medikamente für das Zentralnervensystem. NeuroRx 2, 541–553 (2005).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Rankovic, Z. ZNS-Arzneimitteldesign: Ausbalancieren physikalisch-chemischer Eigenschaften für eine optimale Gehirnexposition. J. Med. Chem. 58, 2584–2608 (2015).

CAS PubMed Google Scholar

Clemons, PA et al. Synthese von Calcineurin-resistenten Derivaten von FK506 und Auswahl kompensatorischer Rezeptoren. Chem. Biol. 9, 49–61 (2002).

CAS PubMed Google Scholar

Kozany, C., März, A., Kress, C. & Hausch, F. Fluoreszenzsonden zur Charakterisierung von FK506-bindenden Proteinen. ChemBioChem 10, 1402–1410 (2009).

CAS PubMed Google Scholar

Dumont, FJ, Staruch, MJ, Koprak, SL, Melino, MR & Sigal, NH Eindeutige Mechanismen der Unterdrückung der murinen T-Zell-Aktivierung durch die verwandten Makrolide FK-506 und Rapamycin. J. Immunol. 144, 251–258 (1990).

CAS PubMed Google Scholar

Ehinger, Y. et al. Die gehirnspezifische Hemmung von mTORC1 eliminiert Nebenwirkungen, die aus der mTORC1-Blockade in der Peripherie resultieren, und reduziert den Alkoholkonsum bei Mäusen. Nat. Komm. 12, 4407 (2021).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sarkaria, JN et al. Verwendung eines orthotopischen Xenotransplantatmodells zur Beurteilung der Wirkung der Amplifikation des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors auf die Strahlungsreaktion des Glioblastoms. Klin. Krebs Res. 12, 2264–2271 (2006).

CAS PubMed Google Scholar

Estrada, AA et al. Entdeckung hochwirksamer, selektiver und hirndurchdringender niedermolekularer Inhibitoren der Aminopyrazol-Leucin-reichen Wiederholungskinase 2 (LRRK2). J. Med. Chem. 57, 921–936 (2014).

CAS PubMed Google Scholar

Lee, BD, Dawson, VL & Dawson, TM Leucinreiche Wiederholungkinase 2 (LRRK2) als potenzielles therapeutisches Ziel bei der Parkinson-Krankheit. Trends Pharmacol. Wissenschaft. 33, 365–373 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rudenko, IN, Chia, R. & Cookson, MR Ist die Hemmung der Kinaseaktivität die einzige Therapiestrategie für die LRRK2-assoziierte Parkinson-Krankheit? BMC Med. 10, 20 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fuji, RN et al. Wirkung der selektiven LRRK2-Kinase-Hemmung auf die Lunge nichtmenschlicher Primaten. Wissenschaft. Übers. Med. 7, 273ra15 (2015).

PubMed Google Scholar

Baptista, MAS et al. LRRK2-Inhibitoren induzieren reversible Veränderungen in der Lunge nichtmenschlicher Primaten ohne messbare Lungendefizite. Wissenschaft. Übers. Med. 12, eaav0820 (2020).

CAS PubMed Google Scholar

Lombardo, LJ et al. Entdeckung von N-(2-Chlor-6-methylphenyl)-2-(6-(4-(2-hydroxyethyl)-piperazin-1-yl)-2-methylpyrimidin-4-ylamino)thiazol-5-carboxamid (BMS -354825), ein dualer Src/Abl-Kinase-Inhibitor mit starker Antitumoraktivität in präklinischen Tests. J. Med. Chem. 47, 6658–6661 (2004).

CAS PubMed Google Scholar

Lassman, AB et al. Phase-2-Studie mit Dasatinib bei ausgewählten Patienten mit rezidivierendem Glioblastom (RTOG 0627). Neuro Oncol. 17, 992–998 (2015).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Medina, PJ & Goodin, S. Lapatinib: ein dualer Inhibitor der Tyrosinkinasen des humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors. Klin. Dort. 30, 1426–1447 (2008).

CAS PubMed Google Scholar

Thiessen, B. et al. Eine Phase-I/II-Studie mit GW572016 (Lapatinib) bei rezidivierendem Glioblastoma multiforme: klinische Ergebnisse, Pharmakokinetik und molekulare Korrelation. Krebs-Chemother. Pharmakol. 65, 353–361 (2010).

CAS PubMed Google Scholar

Bos, PH et al. Entwicklung von MAP4-Kinase-Inhibitoren als Wirkstoffe zum Schutz von Motoneuronen. Zellchemie. Biol. 26, 1703–1715.e37 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, Q. et al. Breitband-Kinase-Profilierung in lebenden Zellen mit auf Lysin ausgerichteten Sulfonylfluorid-Sonden. Marmelade. Chem. Soc. 139, 680–685 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bartholini, G., Burkard, WP, Pletscher, A. & Bates, HM Anstieg der zerebralen Katecholamine durch 3,4-Dihydroxyphenylalanin nach Hemmung der peripheren Decarboxylase. Natur 215, 852–853 (1967).

ADS CAS PubMed Google Scholar

Komm, BS & Mirkin, S. Entwicklung des gewebeselektiven Östrogenkomplexes (TSEC). J. Zelle. Physiol. 228, 1423–1427 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

Chase, TN, Farlow, MR & Clarence-Smith, K. Donepezil plus Solifenacin (CPC-201) Behandlung der Alzheimer-Krankheit. Neurotherapeutics 14, 405–416 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Horlbeck, MA et al. Kompakte und hochaktive Bibliotheken der nächsten Generation für die CRISPR-vermittelte Genrepression und -aktivierung. eLife 5, e19760 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken J. Koach für seine Hilfe bei der Datenverarbeitung; D. Wassarman für Diskussionen; unserem UCSF-Kollegen M. Evans und seiner Gruppe für viele Diskussionen und Bildgebungsstudien des Mausgehirns; und L. Gilbert für die großzügige Spende von K562 CRISPRi (dCas9-KRAB)-Zellen. ZZ ist ein Damon Runyon Fellow, der von der Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2281-17) unterstützt wird. KL erkennt NIH F30CA239476 an. KMS, QF und WAW bestätigen NIH 1R01CA221969. KMS und WAW danken der Samuel Waxman Cancer Research Foundation. WAW dankt NIH U01CA217864 und Cancer Research UK A28592. KMS dankt der Michael J. Fox Foundation P0536220, der Mark Foundation for Cancer Research und dem Howard Hughes Medical Institute.

Abteilung für Zelluläre und Molekulare Pharmakologie, Howard Hughes Medical Institute, University of California, San Francisco, CA, USA

Ziyang Zhang, Kevin Lou und Kevan M. Shokat

Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, San Francisco, Kalifornien, USA

Qiwen Fan, Xujun Luo und William A. Weiss

Abteilung für Neurologie, University of California, San Francisco, CA, USA

Qiwen Fan, Xujun Luo und William A. Weiss

Abteilung für Pädiatrie, University of California, San Francisco, CA, USA

William A. Weiss

Abteilung für Neurologische Chirurgie, University of California, San Francisco, CA, USA

William A. Weiss

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

ZZ, QF, WAW und KMS konzipierten das Projekt, konzipierten und analysierten die Experimente und verfassten das Manuskript. WAW überwachte die In-vivo-Experimente. ZZ führte die chemische Synthese, die biochemischen Tests und Zellkulturexperimente durch und analysierte die Daten. KL führte die Durchflusszytometrie-Experimente und Wachstumshemmungstests in K562 CRISPRi-Zelllinien durch und analysierte die Daten. QF und XL führten die In-vivo-Experimente und die Immunoblot-Analyse der Gewebeproben durch und analysierten die Daten.

Korrespondenz mit Kevan M. Shokat.

ZZ, QF, WAW und KMS sind Miterfinder von Patentanmeldungen für RapaBlock im Besitz von UCSF. KMS ist Erfinder von Patenten für RapaLink-1, die der UCSF gehören und an Revolution Medicines lizenziert sind. KMS erhält eine Geld- und Aktienvergütung und ist SAB-Mitglied von Genentech/Roche, Denali Therapeutics und Revolution Medicines. Angehörige von KL halten Lagerbestände und sind bei Pharmaron beschäftigt.

Nature dankt Nathanael Gray, Ingo Mellinghoff und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Illustration des durchflusszytometrischen Tests zur Beurteilung der zellulären Akkumulation von TAMRA-Verbindungen. b, Struktur einer Fluoreszenzsonde RapaTAMRA. c: Der Abbau von FKBP12 verringert die zelluläre Retention von RapaTAMRA, nicht jedoch von TAMRA-PEG8-N3. Die gezeigten Streudiagramme der Durchflusszytometrie sind repräsentativ für drei unabhängige Replikate, die in den Balkendiagrammen zusammengefasst sind. Die Daten werden als Mittelwerte +/− SD mit einzelnen Datenpunkten dargestellt. Die Faltungsänderung wird als Verhältnis zwischen den Mittelwerten (sgRNA+/sgRNA−) berechnet. Siehe ergänzende Abbildung 2 für die Gating-Strategie.

(a, SLF-Derivate; b, FK506-Derivate). In der Tabelle sind ihre Affinität zu rekombinantem FKBP12 (Fluoreszenzpolarisationsassay) und ihre Wirksamkeit bei der Blockierung der mTOR-Hemmung durch Rapamycin oder RapaLink-1 aufgeführt (bewertet durch Western-Blot-Analyse des p-S6-Spiegels nach Behandlung von MCF7-Zellen mit einer Kombination von 10 nM). Rapamycin/Rapalink + 10 µM Kandidatenverbindung für 24 Stunden. Der P-S6-Gehalt wird als Anteil der DMSO-Kontrolle quantifiziert. ND, nicht bestimmt. Berechnete Werte für logP (cLogP) und topologische polare Oberfläche (tPSA) wurden mit PerkinElmer ChemDraw 16.0 berechnet. Die Zahlen der Wasserstoffbrückenbindungsdonatoren (HBD) und Wasserstoffbrückenbindungsakzeptoren (HBA) wurden bei pH 7,4 mit ChemAxon Marvin Sketch 20.21 bestimmt. Verbindung 06–039 ist identisch mit Verbindung 05–084, wird jedoch in einer separaten Charge hergestellt. Verbindung 06–041 ist identisch mit Verbindung 05–086, wird jedoch in einer separaten Charge hergestellt.

GAPDH ist eine Ladekontrolle. Die Daten in (a) sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Die Daten in (b) stammen aus einem Experiment mit n = 2 für jede Behandlungsbedingung. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

a) Strukturen von RapaBlock und RapaBlock-Ethyloxim. b) RapaBlock-Ethyloxim zeigt eine abgeschwächte Affinität zu FKBP12 (n = 3, Daten werden als Mittelwerte +/− SD dargestellt). c) RapaBlock-Ethyloxim blockiert RapaLink-1 weniger stark. Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

Mäuse wurden intraperitoneal mit einer Einzeldosis RapaLink-1 (1 mg/kg), RapaBlock (40 mg/kg) oder einer Kombination aus beiden behandelt. Die mTOR-Aktivität wurde 15 Minuten vor der Gewebedissektion mit Insulin (250 mU) stimuliert. Das gesamte Gehirn und die Skelettmuskulatur wurden mittels Immunoblot analysiert. Die Intensitäten von p-RPS6 und p-4EBP1 wurden durch Densitometrie mit Silver Fast Scanner und ImageJ-Software quantifiziert und unter jedem Immunoblot als fache Zunahme relativ zu Muskel oder Gehirn ohne Insulinstimulation, normalisiert auf GAPDH, angezeigt. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

a: U87MG-Zellen, die Glühwürmchen-Luciferase exprimierten, wurden intrakraniell in BALB/cnu/nu-Mäuse injiziert. Nach der Tumorbildung wurden die Mäuse in vier Gruppen eingeteilt und alle 5 Tage mit ip-Injektionen des Vehikels, RapaLink-1 (1 mg/kg), RapaBlock (40 mg/kg) oder einer Kombination aus RapaLink-1 und RapaBlock (1) behandelt mg/kg bzw. 40 mg/kg). An den gezeigten Tagen (Tag 0 war Beginn der Behandlung) wurde unter identischen Bildgebungsbedingungen eine Biolumineszenzbildgebung tumortragender Mäuse durchgeführt. b: GBM43-Zellen, die Glühwürmchen-Luciferase exprimieren, wurden intrakraniell in BALB/cnu/nu-Mäuse injiziert. Nach der Tumorbildung wurden die Mäuse in vier Gruppen eingeteilt und alle 5 Tage mit ip-Injektionen des Vehikels, RapaLink-1 (1,2 mg/kg), RapaBlock (60 mg/kg) oder einer Kombination aus RapaLink-1 und RapaBlock (1,2) behandelt mg/kg bzw. 60 mg/kg). An den gezeigten Tagen (Tag 0 war Beginn der Behandlung) wurde unter identischen Bildgebungsbedingungen eine Biolumineszenzbildgebung tumortragender Mäuse durchgeführt.

a, Struktur einer Fluoreszenzsonde FK-TAMRA. b: Der Abbau von FKBP12 verringert die zelluläre Retention von FK-TAMRA. Die gezeigten Streudiagramme der Durchflusszytometrie sind repräsentativ für drei unabhängige Replikate, die in den Balkendiagrammen zusammengefasst sind. Die Daten werden als Mittelwerte +/− SD mit einzelnen Datenpunkten dargestellt. Die Faltungsänderung wird als Verhältnis zwischen den Mittelwerten (sgRNA+/sgRNA−) berechnet. Siehe ergänzende Abbildung 2 für die Gating-Strategie.

a, Strukturen von Dasatinib und FK-Dasatinib. b, Vorgeschlagenes Arbeitsmodell für FKBP-abhängige Kinaseinhibitoren. c, Hemmung von Src-, Csk- und DDR2-Kinasen durch Dasatinib und FK-Dasatinib in Abwesenheit oder Anwesenheit von ergänztem 10 µM rekombinantem FKBP12-Protein (n = 2, Daten werden als einzelne Punkte dargestellt). d, Hemmung der K562-Zellproliferation durch Dasatinib und FK-Dasatinib, in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 µM RapaBlock (n = 3, Daten werden als Mittelwerte +/− SD dargestellt). e, Jurkat-Zellen wurden mit Anti-CD3-Antikörper (OKT3) in Gegenwart von Dasatinib, FK-Dasatinib und/oder RapaBlock stimuliert und mittels Immunoblot analysiert. COX IV ist eine Belastungskontrolle. Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. f, Jurkat-Zellen wurden 1 Stunde lang mit Dasatinib (100 nM) oder FK-Dasatinib (100 nM) pulsbehandelt, dann wurden die Medikamente ausgewaschen und die Zellen wurden in drogenfreien Medien für verschiedene Zeiträume inkubiert, stimuliert mit Anti- CD3-Antikörper (OKT3) 5 Minuten lang inkubiert und mittels Immunoblot analysiert. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. COX-IV ist eine Belastungskontrolle. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1. g, Hemmung von 476 gereinigten Kinasen durch Dasatinib (10 nM) oder FK-Dasatinib (10 nM) in Gegenwart von 10 µM rekombinantem FKBP12-Protein (n = 1). Eine vollständige Liste der Daten zur Kinasehemmung finden Sie in der Ergänzungstabelle 1. h, Kinaseprofilierung von Dasatinib (100 nM Dasatinib) oder FK-Dasatinib (100 nM) in Jurkat-Zellen unter Verwendung der kovalenten Belegungssonde XO44. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente.

a, Chemische Strukturen von Lapatinib und FK-Lapatinib. b, Hemmung der EGFR- und HER2-Kinaseaktivität durch Lapatinib und FK-Lapatinib in Abwesenheit oder Anwesenheit von ergänztem 10 µM rekombinantem FKBP12-Protein (n = 2, Daten werden als einzelne Punkte dargestellt). c, Hemmung der Proliferation von SK-BR3-Zellen durch Lapatinib und FK-Lapatinib in Gegenwart bzw. Abwesenheit von 10 µM RapaBlock (n = 3, Daten werden als Mittelwerte +/− SD dargestellt). d, SK-BR3-Zellen wurden 1 Stunde lang mit Lapatinib, FK-Lapatinib und/oder RapaBlock behandelt und per Immunoblot analysiert. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. GAPDH ist eine Probenverarbeitungskontrolle. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

a, Chemische Strukturen von Prostetin und FK-Prostetin. b, Hemmung der MAP4K4(HGK)-Kinaseaktivität durch Lapatinib und FK-Lapatinib in Abwesenheit oder Anwesenheit von ergänztem 10 µM rekombinantem FKBP12-Protein (n = 2, Daten werden als einzelne Punkte dargestellt).

Diese Datei enthält ergänzende Abbildungen. 1 und 2, Ergänzungstabelle 2 (Ergänzungstabelle 1 wird separat geliefert) und Ergänzende Anmerkungen 1–3 – Einzelheiten finden Sie auf der Inhaltsseite.

Kinase-Profiling-Ergebnisse von FK-Dasatinib.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, Z., Fan, Q., Luo, X. et al. Gehirnbeschränkte mTOR-Hemmung mit binärer Pharmakologie. Natur 609, 822–828 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05213-y

Zitat herunterladen

Eingegangen: 13. Oktober 2020

Angenommen: 09. August 2022

Veröffentlicht: 14. September 2022

Ausgabedatum: 22. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05213-y

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Molekularer Krebs (2023)

Natur (2022)

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.

Blog